Уже не фантазия - о создании анти-ВИЧ вакцины

И. Г. Сидорович
И. А. Николаева
Э. В. Карамов
Государственный научный центр – Институт иммунологии МЗ РФ

Эпидемия ВИЧ/СПИДа, первые случаи которого были описаны в 1981 году, приобрела ныне характер пандемии. За это время число инфицированных превысило более 60 миллионов человек и более 20 миллионов умерло. Несмотря на определенные успехи санитарно-просветительских мер, очевидно, что их недостаточно, чтобы сдержать распространение заболевания. Сегодня признано, что для того, чтобы остановить пандемию, необходима разработка безопасной и эффективной вакцины, и на нее направлены беспрецедентные усилия. Всего с 1986 г. в мире разрабатывалось более 400 экспериментальных вакцин, причем 40 из них были уже испытаны. В настоящее время более 30 кандидатных вакцин находятся на I–II стадиях клинических испытаний, а 2 вакцины уже более года проходят испытания на эффективность (последняя, III фаза) на нескольких тысячах добровольцев. Кроме того, есть ряд перспективных разработок, которые проходят испытания на приматах или подготовлены к началу клинических испытаний. Даже простое перечисление вакцин занимает несколько страниц, и это еще раз указывает на остроту проблемы.

Разработка вакцины против ВИЧ/СПИДа является чрезвычайно трудной задачей. Прежде всего, неясно, что может обеспечить действенную защиту (протективный иммунитет), поскольку, несмотря на сильный гуморальный и клеточный ответ, ВИЧ постоянно размножается в организме зараженных людей. Во-вторых, в результате мутаций образуются варианты вируса, способные уходить от иммунного ответа. В-третьих, вирус может долго существовать в организме в латентном состоянии в виде провирусной ДНК и впоследствии активироваться с развитием настоящего инфекционного процесса. В-четвертых, нет адекватной модели ВИЧ-инфекции на животных. Кроме того, действенная вакцина должна обеспечить иммунитет на слизистых, чтобы пресечь передачу вируса половым путем. Особенно “энергичная” вакцина требуется для защиты от внутривенного заражения.

В этой публикации мы остановимся на рассмотрении самой серьезной фундаментальной проблемы разработки вакцины против ВИЧ/СПИДа – незнании того, что может обеспечить протективный иммунитет. Будут также кратко рассмотрены основные типы разрабатываемых вакцин. Наконец, коснемся того, что делается в этом направлении в нашей лаборатории, в нашем Институте иммунологии.

Начнем с проблемы протективного иммунитета. Из наблюдения за инфицированными людьми мы знаем, что иммунный ответ при ВИЧ-инфекции/СПИДе есть, но он не становится протективным иммунитетом. Вообще говоря, при вирусных заболеваниях важную роль играют обе ветви иммунного ответа: гуморальный, прежде всего, в форме нейтрализующих антител, и клеточный, прежде всего, в форме цитотоксических лимфоцитов-киллеров (CTL). Действие нейтрализующих антител направлено на внеклеточную стадию жизненного цикла вируса, они должны предотвращать проникновение вируса в клетку, тогда как CTL узнают и убивают зараженные вирусом клетки, препятствуя выходу нового зрелого вирусного потомства. Исторически в ходе разработки вакцин против ВИЧ преимущественное развитие сначала получили препараты на основе поверхностных антигенов вируса (в частности, белков оболочки), соответственно с этим основной целью таких вакцин была выработка нейтрализующих антител, затем фокус исследований сместился на вакцины, стимулирующие образование CTL. В настоящее время разрабатываются новые подходы, призванные вызвать образование как нейтрализующих антител, так и цитотоксических лимфоцитов. В соответствии с этим все множество разрабатывавшихся и разрабатываемых вакцинных препаратов может быть разбито на три группы (таблица 1). Как здесь показано, одни препараты направлены в основном на стимуляцию гуморального, другие – клеточного ответа, а третий тип вакцин индуцирует образование того и другого.

Вот только два примера комбинированного подхода:

1) Рекомбинантный вектор (вирус оспы канареек) + рекомбинантный белок gp120

HIV/canaripox recombinant (PMC ALVAC vCP205) (prime) + gp120 subunit (Chiron SF2) (boost).

2) “Голая” ДНК + рекомбинантный белок.

Дальше всех продвинулись клинические испытания, в которых используется комбинированный подход, иными словами, комбинация разных по дизайну вакцин и разных антигенов. В результате ожидается более сильный ответ, более широкого спектра действия или более длительный. Ожидается, что разные вакцинные препараты, введенные одновременно (в одно и то же или разные места) или последовательно должны примировать иммунную систему для разных антигенов, стимулировать разные функции иммунной системы или подхлестнуть (бустировать) имеющийся ответ. Считается, что анти-ВИЧ вакцина будет работать наиболее успешно, если в ней представлены 1) разные антигены, происходящие из одного или многих штаммов; 2) разные способы презентации, стимулирующие разные эффекторы иммунной системы и 3) адъюванты, способные усилить или модулировать иммунный ответ. Комбинированный подход, иначе называемый стратегией “прайм-буст”, в настоящее время стал наиболее популярным. Как уже говорилось выше, считается, что эффективная вакцина против ВИЧ/СПИДа должна индуцировать как гуморальный (прежде всего, в форме вирус-нейтрализующих антител), так и клеточный (цитотоксические лимфоциты, CTL) ответ. Этой цели можно достичь с помощью стратегии “прайм-буст”, когда проводится две или более иммунизации, с применением препаратов различной природы (например, рекомбинантный вирус для первой иммунизации и рекомбинантный белок – для второй).

В связи с этим, включившись в работу над вакциной против ВИЧ/СПИДа, мы начали разработку препаратов для комбинированного подхода к вакцинации. В эту серию препаратов вошли ДНК-вакцина в качестве вектора, стимулирующего клеточный механизм иммунного ответа, и рекомбинантный белок, стимулирующий образование нейтрализующих антител. Предполагалось использовать эти препараты по схеме “прайм-буст”. Еще одной важной частью разработки стало применение безопасного иммуномодулятора-адъюванта – полиоксидония (ПО). Полиоксидоний – оригинальная разработка Института иммунологии. Это высокомолекулярное физиологически активное соединение с выраженной иммунотропностью. ПО представляет собой сополимер N-окиси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1б4-этиленпиперазиния бромида. Мишенями для ПО являются клетки фагоцитарной системы: моноциты и фагоциты. Взаимодействие полиоксидония с нейтрофилами и моноцитами ведет к изменению их функциональной активности, проявляющемуся в усилении синтеза цитокинов и фагоцитоза. Клетками-мишенями для полиоксидония in vitro являются прежде всего факторы естественной резистентности: моноциты/макрофаги, нейтрофилы и НК-клетки, факторы ранней защиты организма от инфекции. Поскольку развитие любого иммунного ответа начинается с клеток моноцитарно-макрофогальной системы, и так как цитокины, продуцируюмые моноцитами/макрофагами, обладают плейтропным эффектом, усиление под влиянием ПО их функциональной активности ведет к активации и клеточного, и гуморального иммунитета. При введении ПО совместно с низкими дозами антигена происходит усиление синтеза антител к этому антигену в 5–10 раз по сравнению с контролем. ПО разрешен для применения в качестве иммуностимулятора-носителя в составе вакцин и для самостоятельного применения в качестве иммуномодулятора. Препарат предназначен для восстановления иммунитета у взрослых и детей, в том числе в терапии ВИЧ-инфекции.

Первой задачей исследования стал выбор антигена с нужными свойствами. Как известно, белки оболочки ВИЧ являются главной мишенью для нейтрализующих антител, тогда как внутренние белки – р24 и р17 – относительно консервативны и содержат эпитопы для CTL и Th1 лимфоцитов. В связи с этим в качестве первого этапа разработки был приготовлен рекомбинантный химерный белок rec (24–41). Для этого была приготовлена плазмида, кодирующая аминокислотные последовательности фрагмента внутреннего белка р17, полноразмерного внутреннего белка р24 и фрагмента трансмембранного белка gp41 ВИЧ1. Этой плазмидой был трансформирован штамм E. coli. Трансформированный штамм активно экспрессировал химерный белок, который составлял не менее 20 % от общего бактериального белка штамма-продуцента. Химерный белок был выделен и очищен с помощью аффинной и ионообменной хроматографии. Белок rec (24–41) был конъюгирован с ПО, и иммуногенность белка и конъюгата была изучена на животных. При этом возникал вопрос о соответствии антигенных детерминант в составе самого химерного белка и его конъюгата аналогичным детерминантам в составе соответствующих прототипных вирусных белков.

Мышей (CBAxC57Bl) F1 иммунизировали разными дозами антигена (rec 24–41) и его конъюгата с ПО (rec 24–-41)-ПО, получали сыворотку обычным способом и с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) определяли уровень сывороточных антител после первой и второй иммунизации. Введение животным антигена rec (24–41) и конъюгата (rec 24–41)-ПО индуцировало сильный гуморальный ответ на обе части химерного антигена (титры антител к р24 в ИФА составили более 200 000, а к gp41 – более 60 000). Специфичность индуцированных антител определяли с помощью иммуноблота. Антитела, возникшие в ответ на введение рекомбинантного химерного антигена, специфически взаимодействовали с соответствующими белками культурального вируса (gp41, p24 и его предшественником р55) в иммуноблоте фирмы Sanofi Pasteur, что свидетельствовало о сходстве рекомбинантного антигена с вирусным прототипом и сохранности основных антигенных детерминант.

Другим методом оценки состояния антигенных детерминант в составе химерного белка и конъюгата была серия опытов по оценке взаимодействия с этими препаратами сывороток ВИЧ-инфицированных лиц. Было показано, что антитела из сывороток ВИЧ-инфицированных специфически взаимодействуют как с химерным белком, так и с конъюгатом, в отличие от сывороток неинфицированных людей. Это явилось еще одним свидетельством сохранности ВИЧ-специфических антигенных детерминант в составе rec (24–41) и конъюгата.

Было показано, что при низких дозах (10 мкг белка rec 24–41 на животное) иммунизация антигеном в составе конъюгата с ПО позволяла получить титры антител, десятикратно превышающие титры антител, индуцированные чистым антигеном.

Иммунизированные животные в ответ на введение химерного белка развивали сильный лимфопролиферативный ответ. Антиген-специфическую пролиферацию лимфоцитов определяли отдельно для клеток лимфатических узлов и селезенки по включению [3H]-тимидина. Результаты определения приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы, индекс антиген-специфический пролиферации составил 10 для клеток селезенки и более 8 для клеток лимфатических узлов.

Следующей задачей было определение способности препарата индуцировать образование вирус-нейтрализующих антител. Мышей линии (СВА х С57 В1/6) F1, самок, весом 16–18 г иммунизировали четыре раза вакциной ВИЧРЕПОЛ. Доза при каждой иммунизации составляла 100 мкг в расчете на rec (24–41) на животное. При первой и второй иммунизации вакцину ВИЧРЕПОЛ вводили животным подкожно. Третий и четвертый раз препарат вводили внутрибрюшинно. Интервалы между первой, второй и третьей иммунизациями составляли 1 месяц, между третьей и четвертой – два месяца. Кровь собирали в стерильных условиях из шейной артерии через 7 дней и получали сыворотку как обычно. Контрольную сыворотку получали от неиммунизированных животных.

Нейтрализующую активность сыворотки определяли в тесте нейтрализации на модели острой инфекции МТ4/ВИЧ-1, при этом использовался референс-штамм HIV-1 IIIB, активно реплицирующийся в Т лимфобластоидных клеточных линиях.

Сыворотку предварительно развели в 20 раз ростовой средой и подвергли тепловой обработке при +56 оС 30 мин для инактивации белков системы комплемента. В лунку 24-луночного планшета одновременно вносили сыворотку (конечное разведение 1:50) и вируссодержащую жидкость (100 ТСID50) в культуру клеток МТ4 (300 тыс. клеток на лунку) в ростовой среде, конечный объем составил 1 мл. Анализ выполняли в трех параллелях. Планшет инкубировали 18 часов при 37о С и 5% СО2. Планшет отмывали путем низкоскоростного центрифугирования при 1100 об/мин в течение 7 мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл свежей ростовой среды. За развитием инфекции наблюдали в течение 5 суток, оценивая цитопатический эффект (цитолиз, синцитиеобразование). Пробы для определения концентрации вирусного антигена р24 отбирали на 3 и 5 сутки. Из лунки брали по 0,5 мл ростовой среды и замещали свежей. Концентрацию вирусного антигена р24 определяли с помощью иммуноферментного анализа (коммерческий набор “Innogenetics”, Бельгия).

Индекс нейтрализации рассчитывали по формуле:

NI= (ODNegSer – ODTestSer)/(ODNegSera – ODCellControl) х 100%

ODNegSer, ODTestSer, ODCellControl представляет собой среднее значение для трех параллельных анализируемых лунок планшета.

Индекс нейтрализации составил 54,9% при разведении иммунной сыворотки 1: 50. Таким образом, антитела, полученные у животных в ответ на иммунизацию rec (24–41), обладают вирус-нейтрализующими свойствами.

Итогом первого этапа разработки вакцины явилось создание препарата “ВИЧРЕПОЛ”, представляющего собой конъюгат химерного белка rec (24–41) c ПО, и вызывающего сильный ВИЧ-специфический гуморальный и лимфопролиферативный ответ.

Параллельно с изучением иммуногенных свойств белка rec (24–41) и конъюгата с ПО были проведены доклинические испытания вакцины “ВИЧРЕПОЛ”, которые продемонстрировали ее безопасность.

В настоящее время препарат “ВИЧРЕПОЛ” проходит контрольные испытания в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Следующий этап работы – получение ДНК-вакцины, кодирующей внутренние белки ВИЧ1, для индукции клеточного ответа (CTL). Производятся также модификации экспрессирующего вектора для получения рекомбинантного белка, содержащего новые антигенные детерминанты из белков оболочки ВИЧ и способного индуцировать нейтрализующие антитела. Совместное применение ДНК-вакцины и рекомбинантного белка по схеме “прайм-буст” позволит индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунитет.

Выполнение этой работы стало возможным благодаря финансовой поддержке Минпромнауки России в рамках Межведомственной программы “Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего”. В настоящее время в распоряжении участников разработки имеется широкий набор биотехнологических методов, налажен весь спектр генно-инженерных методов для получения и усовершенствования генетических конструкций, выделения и очистки рекомбинантных продуктов и иммунологических методов для оценки препарата. Есть возможность организовать производство рекомбинантного антигена. 16.12.2012