Медицина XXI века в свете клеточной биологии

Научная часть состоявшей недавно ХIII сессии общего собрания Российской академии медицинских наук была посвящена внедрению клеточных технологий в медицину. С подробным обзором на эту, столь животрепещущую тему в науке, выступил на сессии академик РАН и РАМН М. А. ПАЛЬЦЕВ.

Какими бы впечатляющими ни были успехи генетики, теперь уже ясно, что наследственная информация реализуется на уровне клетки. Постоянно появляются новые данные об адгезивных молекулах, цитокинах, ростовых факторах, путях сигнальной трансдукции, роли внеклеточного матрикса, ионных каналах и рецепторах.

Успехи клеточной биологии и смежных дисциплин создали надежный фундамент для разработки новых подходов в лечении различных заболеваний. Несомненно, клиническая и профилактическая медицина XXI века будет основана на достижениях клеточной биологии.

О том, что первой и важнейшей структурной единицей жизни является клетка, представляющая собой самую общую и самую постоянную форму живой материи, впервые заявил Р. Вирхов. Он с особой настойчивостью повторял, что клетка построена по принципу «постоянно повторяющегося устройства». «Устройства», не подлежащего дальнейшему разложению на части, поскольку только в клетке молекулы могут приобрести ту, строго определенную, структурную взаимосвязь, которая обеспечивает возникновение всех «феноменов жизни» и в первую очередь репродукции («omnius cellula e cellula» – всякая клетка из клетки).

«Клетка, – указывал Р. Вирхов, – есть последний морфологический элемент всех живых тел... Мы не имеем права искать настоящей жизнедеятельности вне ее. Каждое животное является суммой жизненных единиц, из которых всякая отдельно взятая содержит все необходимое для жизни». Опираясь на эти универсальные, с его точки зрения, принципы организации живой материи, Р. Вирхов прямо заявил, что материальным субстратом и одновременно единственно возможным «местом» болезни в организме человека является клетка, а болезнь есть ни что иное, как сумма поражения множества отдельных клеток.

Открытие внутриклеточных органелл, по­строенных по принципу «постоянно повторяющегося устройства» и обладающих «всеми признаками жизни», неклеточных форм жизни (вирусов), а главное феноменальные успехи генетики, энзимологии, биохимии и гистохимии, молекулярной биологии не только создали необходимую почву для появления нового направления патологии – молекулярной патологии, но и казалось бы навсегда поставили крест на целлюлярной патологии.

Однако с течением времени становится все более очевидным, что целлюлярную патологию слишком рано списали в анналы истории. Первыми ушли в небытие спекуляции на тему о спонтанном образовании живых структур из неживого вещества.

Недавняя расшифровка генома человека уточнила наследуемую программу развития организма из одной клетки-зиготы в сложно организованную многоклеточную систему. Стало ясно, что геном – это целостная система наследственной информации организма. Если бы геном был не только целостной, но и самостоятельной единицей, то вся совокупность клеточных ингридиентов могла бы создаваться полностью de novo при условии целостности генома и наличия биосинтетического аппарата. Однако ни ядро, ни эндо­плазматический ретикулум, ни аппарат Гольджи, ни плазматические мембраны, ни лизосомы не могут быть созданы абсолютно заново, без наличия хотя бы фрагментов этих структур. Эти органеллы перед клеточным делением распадаются на фрагменты и затем собираются заново из этих фрагментов. Можно предположить, что предсуществующие фрагменты играют роль матриц, которые определяют корректность сборки. Геном не в состоянии из отдельных молекул воссоздать эти матрицы, появившиеся в какой-то момент эволюции и получившие автономность от генома. Такие функции под силу только клетке.

В последние годы сложились отчетливые представления о наиболее перспективных клеточных технологиях, использующих современные достижения клеточной биологии: первичные клеточные культуры, клеточная инженерия, тканевая инженерия.

Первичные клеточные культуры

Успехи в области клеточной и молекулярной биологии привели к значительному прогрессу в технологиях клеточных культур. Использование систем in vitro стало не только основополагающим подходом для изучения механизмов функционирования клеток, но и ведущим инструментом для управления клеточными процессами, в частности, активного контроля пролиферации и дифференцировки. Первичные клеточные культуры наиболее полно отражают структурный и функциональный потенциал тех тканей, из которых они были выделены. С одной стороны, этот метод служит прекрасным инструментом для изучения фундаментальных основ межклеточных взаимодействий в исследуемом органе, с другой – первичные культуры позволяют наиболее эффективно проводить первичный скрининг разрабатываемых лекарственных средств на стадии доклинических испытаний.

В Московской медицинской академии имени И. М.Сеченова разработаны методы получения различных первичных клеточных культур, в частности, рака предстательной и молочной желез. Эти клеточные культуры полностью отражают морфологическую картину, характерную для конкретных больных.

Данный подход позволяет изучать роль цитокинов и ростовых факторов при разных патологических процессах. Так, нами было показано, что одним из основных факторов, опосредующих формирование реактивной стромы в немалигнизированных участках предстательной железы, является трансформирующий фактор роста (ТФР), содержание которого в супернатантах культур в несколько раз превышает тот же показатель в культурах, полученных непосредственно из фокусов злокачественного опухолевого роста. Реакцию стромального компонента немалигнизированных участков опухоли, ассоциированных с очагами инвазивного роста, можно рассматривать как защитный механизм, препятствующий инвазии клеток карциномы в строму органа и сдерживающий ее прогрессирование. Эта работа проводится совместно с Московским институтом онкологии имени П. А. Герцена.

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия основывается на выделении определенных типов клеток, придании им in vitro c помощью генетических конструкций или сигнальных молекул специфических свойств и введении их в организм больного. Наиболее ярким примером клеточной инженерии является использование дендритных клеток для модуляции иммунного статуса.

Хотя дендритные клетки были описаны в середине XIX века как антигенпредставляющие клетки, объектом пристального изучения они стали только в 70-х годах XX века, когда было показано, что лимфоидные дендритные клетки являются сильными стимуляторами первичного иммунного ответа. Дендритные клетки отличаются от других антигенпредставляющих клеток (В-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов) тем, что, во-первых, их стимулирующий эффект на Т-лимфоциты в 10–100 раз сильнее, а, во-вторых, дендритные клетки являются единственными антигенпредставляющими клетками, которые способны представлять наивным Т-клеткам неизвестные антигены и усиливать иммунный ответ.

Существует несколько популяций дендритных клеток. Их морфология, фенотип (экспрессия молекулярных маркеров) и функция зависят от того, в какой стадии развития они находятся, т. е. от их активации и дифференцировки.

Дендритные клетки представляют собой и векторы, и мишени для изменения иммунного статуса организма. Они обладают уникальной способностью представлять антигены наивным Т-лимфоцитам и таким образом участвуют в определении направленности иммунных реакций. В связи с этими свойствами возлагается много надежд на возможное их использование в модуляции иммунного ответа при опухолях, инфекционных и аутоиммунных заболеваниях. Клинические испытания клеточных вакцин на основе дендритных клеток, несмотря на обнадеживающие результаты при лечении опухолевых заболеваний, еще находятся в начальной фазе.

В Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова разрабатываются различные подходы для получения дендритных клеток из различных источников и придания им специфических свойств с целью последующего введения их в организм больного, например, для иммунотерапии онкологических больных.

Основными этапами создания клеточных вакцин для лечения инфекционных заболеваний являются:

1) изучение механизмов, с помощью которых микроорганизмы модулируют экспрессию генов и функции дендритных клеток;

2) определение рецепторов дендритных клеток и сигнальных путей, через которые действуют микробные стимулы;

3) создание медиаторов, активирующих дендритные клетки в определенном направлении, для стимуляции иммунного ответа;

4) выбор дизайна векторов, продуцирующих данные медиаторы и стимулирующих дендритные клетки in vitro.

Такая стратегия исследований по использованию дендритных клеток должна привести к созданию новых лекарств и вакцин, которые позволят стимулировать иммунитет против различных инфекций и злокачественных новообразований или тормозить его при аутоиммунных заболеваниях и трансплантации органов и тканей.

Популярность стволовых клеток связана с их способностью к самоподдержанию. Соматические стволовые кроветворные клетки, несмотря на их малочисленность, легко выделяются из периферической крови и костного мозга взрослых и из пуповинной крови новорожденных, идентифицируются и достаточно хорошо сохраняются при лабораторных манипуляциях. Кроме того, стволовые клетки способны к дифференцировке в различные клетки крови и иммунной системы, а также в клетки других тканей.

Надежды исследователей связаны с возможностью использования для генной терапии и других соматических стволовых клеток, в частности, миобластов. Они легко встраиваются в мышечные фибриллы, становясь составной частью мышечной ткани. Поскольку генетически модифицированные миобласты в мышечной ткани взаимодействуют с нервами и сосудами, их можно использовать для лечения не только мышечных, но и нейродегенеративных и эндокринных заболеваний, а также гемофилии и ряда опухолей.

Возможности клеточной инженерии существенно расширяются в комбинации с генной инженерией. В выделенные от пациента клетки и размноженные in vitro фибробласты, лимфоциты, стволовые клетки и т. д. вводится соответствующий ген. Клетки тестируются и вводятся пациенту (ex vivo).

Более 40% (свыше 450) клинических испытаний способов генной терапии проводится с использованием клеточных технологий. Из них в 40% случаев в качестве носителей гена используются стволовые кроветворные клетки.

Тканевая инженерия

Тканевая инженерия является самостоятельным междисциплинарным направлением, связанным с восстановлением, поддержкой или улучшением функций органов и тканей. Тканевая инженерия отличается от стандартной терапии тем, что сформированная инженерным путем ткань интегрируется в организм пациента, осуществляя постоянное и специфическое лечение болезни.

При создании новой ткани используют один из трех общих подходов:

1. Дизайн и выращивание ткани человека in in vitro последующей ее имплантацией для восстановления или замещения поврежденных тканей. Наиболее ярким примером подобной терапии является пересадка компонентов кожи при лечении ожогов, использующаяся в клинике более 10 лет.

2. Имплантация клеток с индукторами репарации или регенерации поврежденных тканей. Этот подход основан на выделении клеток, добавлении к ним определенных сигнальных молекул и переносе этих клеток в биоматериалы, обеспечивающие регенерацию тканей. Чаще всего в качестве биоматериалов используются полимеры, образующие трехмерные конструкции, удобные для прикрепления и роста клеток, реконструирующих поврежденные ткани. Примером такого биоматериа­ла может служить биоматрикс, стимулирующий рост костной ткани при заболеваниях периодонта.

3. Мобилизация собственного потенциала тканей для восстановления функции поврежденных органов и тканей. При этом используется техника выделения стволовых клеток, которые либо имплантируются пациенту непосредственно в суспензии или в структурном матриксе, либо после их коммитирования in vitro.

Возможность гистотипического восстановления поврежденных тканей и органов представляет значительный интерес. Современные методы изоляции клеток и подходы к их культивированию предполагают использование как специализированных зрелых клеток, так и их предшественников на любых этапах дифференцировки. Многообещающие перспективы развития тканевой инженерии связаны с возможностью использования в качестве исходного материала не только ксено - и аллогенных источников, но и аутогенных клеток, размноженных вне организма и ретрансплантированных в составе реконструированной ткани. Такой подход в самом ближайшем будущем может стать реальной альтернативой классической трансплантологии.

Первым органом, который попытались воссоздать ex vivo, стала кожа человека. Все исследования, проводимые на клеточной модели кожи, имеют большое значение в таких областях медицины, как фармакология (при доклинических испытаниях лекарственных средств), косметология (при испытаниях косметических средств), токсикология, дерматология (при инфекционно-аллергических заболеваниях кожи), хирургия и травматология (при заживлении ран и пересадке кожи).

В НИИ молекулярной медицины ММА имени И. М. Сеченова, совместно с Институтом биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН, проводятся исследования по изучению механизмов репарации длительно незаживающих кожных ран различной этиологии с помощью ауто - и аллогенных фибробластов, кератиноцитов и трупного эпидермиса. Проведенные исследования показали, что в зоне длительно незаживающих ран изменяется клеточный состав, структура внеклеточного матрикса, активность протеиназ и факторов роста, что препятствует их репарации. Использование аллогенных кератиноцитов, фибробластов или трупного эпидермиса в качестве трансплантатов с одинаковым эффектом (около 70 % случаев) вызывало нормализацию структуры дермы, что способствовало успешному заживлению ран.

Данные, полученные в результате гистотипического восстановления поврежденных тканей и органов, послужили основанием для имплантации аллогенных клеток, содержащих индукторы репарации или регенерации поврежденных тканей. Изучена динамика репаративных процессов в коже после трансплантации трехмерного коллагенового геля с включенными в него культивированными аллогенными фибробластами (стромального эквивалента) при лечении глубоких дефектов роговицы ожоговой этиологии. Особенностью репарации на фоне трансплантации аллогенных фибробластов в коллагеновом геле является гистотипический характер заживления. При этом коллагеновый гель, являющийся основой трансплантата, служит каркасом для миграции собственных фибробластов, которые формируют базальную мембрану и инициируют миграцию вновь формирующегося эпителия.

Значительные перспективы для восстановления функции пораженных органов и тканей сулит техника, связанная с использованием стволовых клеток.

Известно несколько видов стволовых клеток:

l эмбриональная стволовая клетка (из бластоцисты);

l стволовая клетка эмбриональных тканей;

l стволовая клетка дифференцированных тканей (соматическая стволовая клетка).

Все стволовые клетки, независимо от происхождения и источника выделения, обладают тремя общими уникальными свойствами:

l способны к самоподдержанию в течение длительного времени;

l не специализированы, т. е. не имеют каких-либо тканеспецифических маркеров, ответственных за выполнение специальных функций;

l способны к дифференцировке в любые специализированные клетки.

История изучения стволовых клеток берет начало с концепции стволовой клетки, предложенной русским гистологом А. А. Максимовым в 1908 году применительно к кроветворной ткани.

Середина 70-х годов XX века ознаменовалась крупным успехом в изучении клеточного состава костного мозга и открытии в его строме мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток группой отечественных ученых во главе с А. Я. Фриденштейном.

Отличительной особенностью эмбриональных стволовых клеток является их способность к бесконечной пролиферации симметричным делением в лабораторной культуре и выраженная клоногенность, т. е. способность к образованию из одной первоначальной стволовой клетки целой линии генетически идентичных стволовых клеток.

В конце 90-х годов в изучении эмбриональных стволовых клеток были достигнуты значительные успехи. После выделения плюрипотентных линий из предимплантационных эмбрионов опубликован огромный материал, касающийся биологии эмбриональных стволовых клеток и результатов направленной дифференцировки в специализированные клеточные типы. В опытах на линиях мышиных эмбриональных стволовых клеток получены кардиомиоциты, кроветворные клетки-предшественники, клетки желточного мешка, скелетные миоциты, гладкомышечные клетки, адипоциты, хондроциты, эндотелиальные клетки, меланоциты, нейроны, глия, островковые клетки поджелудочной железы, примитивная энтодерма.

Подавляющее большинство публикаций последних лет посвящено эмбриональным стволовым клеткам как наиболее многообещающим для развития клеточных технологий. Выработан ряд критериев использования эмбриональных стволовых клеток в клинической практике:

l выделение эмбриональных стволовых клеток и получение их культур с направленной дифференцировкой;

l проведение теста на физиологическую функциональность эмбриональных стволовых клеток в культуре;

l проведение теста на функциональную эффективность на моделях;

l проведение теста на безопасность на животных;

l тестирование полученных клеток на возможность развития реакции отторжения.

Однако имеются серьезные аргументы против использования эмбриональных стволовых клеток в лечении заболеваний:

1. Иммунологическая несовместимость клеток, пересаживаемых реципиенту. Несмотря на тщательный подбор донора и реципиента по антигенам главного комплекса гистосовместимости, а также успехи иммуносупрессивной терапии, вероятность иммунологического отторжения крайне велика. Пересаживая эмбриональные стволовые клетки, подобно трансплантируемым органам, вы не излечиваете больного, а продлеваете его жизнь.

2. Неполное соответствие условий клеточной дифференцировки in vivo и in vitro. Для корректной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток необходимы многочисленные факторы, например, механическое натяжение, разнообразие электрических полей, комплекс микроокружения, способствующих упорядоченной активации и экспрессии генов. Полное воспроизведение этих немолекулярных компонентов эмбрионального развития пока не реально. Трансплантация пациенту некорректно дифференцированных клеток представляет собой серьезный риск, связанный с высоким туморогенным потенциалом эмбриональных стволовых клеток.

3. Невозможность обнаружения генетических дефектов до пересадки эмбриональных стволовых клеток. Генно-инженерные манипуляции, способные изменить иммунные характеристики эмбриональных стволовых клеток и снизить риск развития реакции «трансплантат против хозяина», не могут обеспечить полную безопасность для пациента. Риск появления генетических мутаций при генно-инженерных манипуляциях вполне реален. Не исключено, что эти мутации будет сложно обнаружить до трансплантации.

4. Отсутствие доказательств эффективности и безопасности применения эмбриональных стволовых клеток. До настоящего времени не доказано, что клетки, образованные из эмбриональных стволовых клеток, можно безопасно трансплантировать взрослому животному для восстановления функции поврежденной ткани или органа. Ситуация, сложившаяся к настоящему времени с эмбриональными стволовыми клетками, напоминает эксперименты с генной терапией – большие надежды, большие проблемы и пока невысокий эффект.

Предлагаемое, в качестве альтернативы, т.н. «терапевтическое клонирование», когда генетическая информация стволовой клетки замещается генетической информацией от пациента, достаточно опасно, так как в таких «терапевтических» клонах велика вероятность возникновения аномалий, делающих невозможным их использование для лечения.

5. Этические проблемы. Необходимость преодоления серьезных ограничений по использованию эмбриональных стволовых клеток была бы очевидной в отсутствие видимой альтернативы эмбриональным стволовым клеткам. Однако в последние годы наметился значительный прогресс в области исследований соматических стволовых клеток.

Огромный интерес представляют недавно открытые свойства пластичности соматических стволовых кроветворных клеток и иных соматических стволовых клеток. Они дифференцируются в ограниченное число клеточных типов, т. е. имеют потенциал мульти - или унипотентного созревания и не обладают плюрипотентностью – способностью давать начало всем клеточным типам, образующимся из трех зародышевых листков.

Исследования последних лет продемонстрировали возможность не только выделения соматических стволовых клеток человека, но и их направленную дифференцировку in vitro и in vivo.

Преимущества использования соматических стволовых клеток вместо эмбриональных очевидны.

1. Соматические стволовые клетки получают из тканей самого пациента, поэтому проблемы иммунологического отторжения не существует.

2. Стволовые клетки из дифференцированных тканей не вызывают образования тератом.

3. Терапевтическое использование соматических стволовых клеток самого пациента не создает этических проблем.

В последнее десятилетия были разработаны различные техники выделения и обогащения кроветворных стволовых клеток из периферической крови, костного мозга и пуповинной крови, которая является наиболее перспективным источником получения кроветворных стволовых клеток. В нашей стране, вслед за странами Западной Европы и США, создаются банки кроветворных стволовых клеток, в которых кроветворные стволовые клетки не только находятся на хранении, но и могут использоваться для аллогенных трансплантаций и генной терапии.

За последние пять лет опубликованы сотни сообщений по применению соматических стволовых клеток (в первую очередь кроветворных стволовых клеток) в эксперименте и клинике.

Существует ряд проблем, связанных с использованием соматических стволовых клеток.

1. Соматические стволовые клетки, в отличие от эмбриональных стволовых клеток, плохо растут в культуре и ограничены к дифференцировке в любые другие клеточные типы.

2. Несмотря на многочисленные публикации, пока не ясно, как долго можно поддерживать и коммитировать соматические стволовые клетки из дифференцировванных тканей в зрелые клетки любых других тканей.

3. Использование стволовых клеток в регенераторной медицине сопряжено с проблемой их идентификации. Не существует надежных маркеров, позволяющих достоверно определять соматические стволовые клетки в различных тканях.

В связи с этим, эмбриональные стволовые клетки кажутся более привлекательными, поскольку доказана их способность (в эмбриональном микроокружении) генерировать все клеточные типы. На практике, однако, чрезвычайно трудно получить в культуре из эмбриональных стволовых клеток тот тип клеток, который планируется. Одним из вариантов решения этой проблемы является получение стволовых клеток из пуповинной крови новорожденных и их хранение в банках стволовых клеток.

Дальнейший прогресс как самой клеточной биологии, так и медицинской науки в целом, будет связан не только и не столько с дальнейшим накоплением фактического знания, сколько с его творческим осмыслением. Пока аналитическая работа ученых явно превалирует над синтезом, поэтому необходимость теоретической концепции, подобной той, что в середине XIX века предложил Р. Вирхов, необходима как никогда, концепции, построенной на фундаменте нового знания и способной определить как направление, так и содержание дальнейшего развития современной патологии.

Открытие стволовой клетки и развитие связанных с этим открытием клеточных технологий в медицине, наряду с расшифровкой двойной спирали ДНК и генома, безусловно, относятся к важнейшим событиям, произошедшим в биологии в XX веке. Именно клеточные технологии являются основой генной терапии, с которой связаны надежды на разработку индивидуальных схем лечения больных самыми тяжелыми, в т. ч. и наследственными заболеваниями.

Клеточные технологии и генная терапия представляют собой наиболее универсальные современные подходы к лечению. Медицина XXI века, безусловно, будет основана на фундаментальных достижениях биологической науки и ряда смежных наук. Это еще раз продемонстрировала прошедшая в декабре 2003 года сессия Общих собраний РАН и РАМН. На ней было принято решение о формировании крупной федеральной целевой программы, направленной на решение фундаментальных проблем медицинской науки, прежде всего, усилиями научных коллективов двух академий. 16.12.2012